海藻糖-6-磷酸酯酶（Trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP） 试剂盒说明书

货号：YX-W-TPP                                 微量法 100 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

海藻糖又称为漏芦糖、蕈糖，是由两个葡萄糖分子组成的一个非还原性双糖，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖，海藻糖-6-磷酸酯酶 （trehalose 6-phosphate phosphatase，TPP）是该途径中海藻糖合成关键酶之一，该反应在海藻糖-6-磷酸合成酶

（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-

磷酸葡萄糖生成中间产物6-磷酸海藻糖，再在TPP的作用下去磷酸化，生成海藻糖。

测定原理：

TPP 催化海藻糖-6-磷酸产生海藻糖，同时释放出磷酸根，使用钼锑抗比色法测定。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 6mL×1 支，4℃保存。

试剂三： 粉剂×1 支，4℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水溶解。用不完的试剂 4℃保存。试剂四： 粉剂×3 支，4℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水溶解。现配现用。

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量

（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。测定步骤

1、在EP 管中加入如下试剂

混匀，37℃反应 30min，95℃水浴 5min 终止反应，冷却至室温。10000g 4℃离心 5min，取反应液待测。

2、显色液的配制（可测 50 管）：取 EP 管一支，加入 660μL 试剂二，再加入 100μL 试剂三， 充分混匀后，再加入 240μL 试剂四，充分混匀待用；配好的显色液应为黄色，若变蓝则为磷污染；显色液现配现用；若一次性测不了 50 个样，可按比例缩小各试剂体积。

3、在 96 孔板中加入如下试剂

测定 660nm 处吸光值A，分别记为A 对照和 A 测定，△A=A 测定-A 对照。

TPP 活力计算：

标准条件下标准曲线为 y = 1.9403x - 0.0036，R2 = 0.9985；其中 x 为标准品浓度，μmol/mL，

y 为吸光值△A。

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。

TPP 活力( nmol/min/mg prot)=（ΔA+0.0036）÷1.9403×V 反总÷（V 样×Cpr ）÷T× 1000

=34.35×（ΔA+0.0036）÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。

TPP 活力(nmol/min/g 鲜重)=（ΔA+0.0036）÷1.9403×V 反总÷（W× V 样÷V 样总）÷T× 1000

=34.35×（ΔA+0.0036）÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。

TPP 活力(nmol/min/104 cell)=（ΔA+0.0036）÷1.9403×V 反总÷（V 样×细胞数量）÷T× 1000

=0.069×（ΔA+0.0036）

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；细胞数量，500 万；1000，μmol 到 nmol 的换算系数。